Utilização de biópsia líquida baseada em detecção de DNA tumoral em urina e plasma em pacientes com carcinoma renal de células claras / Use of liquid biopsy based on detection of tumor DNA in urine and plasma in patients with clear cell renal carcinoma

O carcinoma de células renais (CCR) é o sétimo tipo de câncer mais comum no ocidente e vêm apresentando um aumento em sua prevalência. A classificação histológica dos CCRs é a abordagem mais utilizada para determinar o subtipo da doença, bem como prognosticar o paciente. Cerca de 70-80% dos CCRs é do subtipo células claras (ccRCC), o qual representa o subtipo mais prevalente e agressivo da doença. A escolha do tratamento difere para cada paciente, sendo a ressecção cirúrgica a terapia mais efetiva nos casos de doença localizada. Apesar de ser um tratamento já estabelecido, estudos mostram uma certa heterogeneidade entre massas renais detectadas, onde cerca de 20% apresentam um perfil benigno, 60% são considerados tumores indolentes, sugerindo desta forma que, entender de forma mais detalhada este tumor pode auxiliar na escolha de um tratamento mais direcionado para o paciente. Sendo assim, o presente trabalho buscou selecionar genes potencialmente alterados em CCR com o intuito de customizar um painel multigênico capaz de identificar variantes somáticas, específicas do tumor, e avaliar as variantes específicas do tumor de forma personalizada em amostras de ctDNA (DNA tumoral circulante) extraídas de plasma e dos dois componentes da urina (sedimento e sobrenadante) coletados no momento da cirurgia (baseline). Neste contexto, dentro de nossa proposta, construímos um painel com 28 genes associados com CCR e sequenciamos 89 casos de tumores renais, juntamente com as amostras de leucócitos. Identificamos que dentre os tumores analisados, 59 apresentavam pelo menos uma variante somática, ou seja, o painel customizado apresentou uma sensibilidade para identificar variantes somáticas em 66% dos casos. Com relação aos 45 tumores classificados como ccRCC em 38 casos identificamos pelo menos uma marca tumoral, ou seja, nosso painel foi capaz de detectar variantes somáticas específicas do tumor em 84,4% desses casos. Um total de 105 variantes somáticas foram identificadas, e os genes mais frequentemente mutados nessa coorte de pacientes foram os genes VHL, PBRM1, BAP1, SETD2. Dos 59 casos em que identificamos variante somática, 44 casos foram avaliados as amostras baseline de plasma e 29 casos de urina (sobrenadante e sedimento), e encontramos pelo menos uma marca tumoral em um dos fluidos corpóreos em 11 pacientes, 6 em amostras de plasma e 6 amostras de urina. Através do desenvolvimento deste estudo, confirmamos que o subtipo ccRCC é o CCR mais bem caracterizado genomicamente e que é importante continuar a investigação genômica principalmente nos subtipos não ccRCC. Além disso o estudo demonstra a viabilidade de utilizar biópsia líquida ctDNA tanto no plasma quanto na urina para fins de diagnóstico e prognóstico.

Renal cell carcinoma (RCC) is the seventh most common type of cancer in the West and its prevalence is increasing. The histological classification of RCCs is the most used approach to determine the disease subtype as well as the patient's prognosis. About 70% of RCCs are of the clear cell Renal Cell Carcinoma subtype (ccRCC), which represents the most prevalent and aggressive subtype of the disease. The choice of treatment is different for each patient. Resection is one of the most effective therapies in cases of localized disease. Despite being an established treatment, studies show a certain heterogeneous profile studied. In this profile, up to 20% even present a benign treatment, helping the indolent, thus suggesting that understanding this tumor in detail can help to choose a more targeted treatment for the patient. Therefore, the present work aimed to select potentially altered genes in CCR in order to customize a multigene panel capable of identifying somatic, tumor-specific variants, and to evaluate the tumor-specific variants in a personalized way in ctDNA (circulating tumor DNA) samples extracted from plasma and from two components of urine (sediment and supernatant) collected at the time of surgery (baseline). In this context, within our proposal, we built a panel with 28 genes associated with CCR and sequenced 89 cases of renal tumors, together with leukocyte samples. We identified that among the analyzed tumors, 59 had at least one somatic variant, that is, the customized panel showed sensitivity to identify somatic variants in 66% of cases. Of the 45 classified as ccRCC in 38 cases we identified at least one tumor marker, that is, our panel was able to detect tumor-specific somatic variants in 84.4%. A total of 105 somatic variants were identified, and the genes most frequently mutated in this cohort of patients were the VHL, PBRM1, BAP1, SETD2 genes. Among 59 cases in which we identified somatic variant, 44 cases were evaluated in baseline plasma samples and 29 cases in urine (supernatant and sediment), and we found at least one tumor mark in one of the body fluids in 11 patients, 6 in plasma samples and 6 urine samples. Through the development of this study, we confirm that the ccRCC subtype is the best genomically characterized CCR and that it is important to continue genomic investigation, especially in the non-ccRCC subtypes. Furthermore, the study demonstrates the feasibility of using ctDNA liquid biopsy in both plasma and urine for diagnostic and prognostic purposes.

Investigação de causas genéticas associadas ao desenvolvimento de sarcomas em idade jovem / Investigation of genetic causes associated with the development of sarcomas at young age

Os avanços recentes na genômica permitiram o reconhecimento de quase uma centena de novos genes de predisposição ao câncer (GPC). Embora o rastreamento genético de uma parte destes genes esteja atualmente bem estabelecido para os tumores hereditários mais comuns, há uma série de tumores raros, como sarcomas, que podem estar associados a síndromes de câncer hereditário, mas cuja relação genótipo-fenótipo ainda é desconhecida. Dessa forma, o presente estudo propôs-se a: definir a frequência de variantes raras germinativas patogênicas em GPCs em crianças, adolescentes e adultos jovens com sarcomas; avaliar as características moleculares dos tumores para confirmar sua causa genética em casos selecionados, realizando análise de perda de heterozigose (LOH); identificar novos genes e vias relevantes associados ao desenvolvimento de condrossarcomas e sarcomas ultrarraros. Para isso, foram rastreadas variantes germinativas em 177 pacientes jovens diagnosticados com sarcoma abaixo de 40 anos, através da análise de sequenciamento de nova geração, com painéis customizados de 113/126 GPCs. Primeiramente, foi rastreada a variante fundadora do gene TP53 mais prevalente na população brasileira (p.Arg337His) e 5/177 pacientes foram detectados como portadores e excluídos da análise de painel. No painel, foram avaliados 172 pacientes e em 33 foram detectadas variantes patogênicas (P) ou provavelmente patogênicas (PP) (18,6%), sendo estas em genes previamente associados ao risco no desenvolvimento de sarcomas, como CHEK2, EXT1, EXT2, NF1, RB1 e TP53, mas também em genes no qual esse risco ainda é desconhecido (AKT1, ERCC3, ERCC4, FANCM, MITF, MUTYH, NTHL1, SLX4 e TSC2) ou é emergente (BRCA2, ERCC2, PALB2). Cento e trinta e nove (78,5%) pacientes tiveram variantes de significado incerto ou foram negativos. Portadores de variantes P/PP foram mais propensos a apresentar mais de um tumor primário do que não portadores (21,1% X 6,5%; p=0,012). Dos 25 tumores avaliados para LOH, a perda do alelo selvagem foi detectada em nove (36%), sendo um dos genes de associação desconhecida a sarcomas (MITF). Para explorar novos genes candidatos, 9 pacientes com condrossarcomas ou sarcomas ultrarraros negativos para variantes P/PP foram incluídos em análise de sequenciamento de exoma tumoral e germinativo. Foram priorizadas na análise germinativa variantes em 10 GPCs conhecidos e 22 genes com variantes de perda de função e missenses em que a relação com câncer hereditário é desconhecida. Foi encontrada somente uma variante em um gene associado a sarcomas (RECQL4) e em um gene emergente (BRCA2). Uma variante patogênica no gene RAD50 foi detectada em um paciente com sarcoma fibromixóide. Em dois tumores distintos, foi observada alteração no gene COL7A1. Na análise somática, em três genes (TP53, PTCH1, CREBBP) foram encontradas alterações potencialmente significantes clinicamente, visto que são genes de associação conhecida a sarcomas. Também foram identificados outros genes mutados, alguns deles incluídos em vias biológicas que podem ser interessantes para sarcomas, como VPS16 e MYF6. Contudo, para que seja possível realizar associações genótipofenótipo dos dados de exoma, tanto germinativo quanto somático, outras evidências são necessárias, como análise de transcriptoma e co-segregação. Com os dados do painel, nossos resultados destacam uma alta taxa de variantes P/PP em GPCs em pacientes jovens brasileiros com sarcoma (21,5% incluindo os pacientes portadores da variante TP53 p.Arg337His), mesmo em pacientes sem história familiar de câncer. As taxas de variantes P/PP variaram de 0% a 33% entre os subtipos de sarcoma e exibiram associações específicas entre subtipos e genes. Isso aponta a urgência de implementar estratégias de triagem genética adequadas para esses indivíduos e suas famílias.

Recent advances in genomics have allowed the recognition of nearly a hundred new cancer predisposing genes (CPGs). Although genetic screening in some of these genes is currently well established for the most common hereditary tumors, there are a number of rare tumors, such as sarcomas, that may be associated with hereditary cancer syndromes, but whose genotypephenotype relationship is still unknown. Thus, the present study aimed to: define the frequency of rare pathogenic germline variants in CPGs in children, adolescents and young adults with sarcomas; assess the molecular characteristics of tumors to confirm their genetic cause in selected cases, performing loss of heterozygosity (LOH) analysis; identify novel genes and relevant pathways associated with the development of chondrosarcomas and ultra-rare sarcomas. For this, we searched for germline variants in 177 young patients diagnosed with sarcoma under 40 years old, through next-generation sequencing analysis, with customized panels of 113/126 CPGs. First, we searched for the founder variant in TP53 gene (p.Arg337His) - most prevalent in the Brazilian population - and found that 5/177 patients were detected as carriers, being excluded from the panel analysis. In the panel, 172 patients were evaluated and in 33 (18.6%) there were detected germline pathogenic variants (GPVs), occurring in genes previously associated with the risk of developing sarcomas (TP53, RB1, NF1, CHEK2, EXT1 and EXT2), but also in genes where that risk is still unknown (ERCC2/3, TSC2, RAD50, FANCM, and others) or is emerging (PALB2, BRCA2). GPVs carriers were more likely to present more than one primary tumor than non-carriers (21.1% X 6.5%; p=0.012). One hundred and thirty-nine (78.5%) patients had variants of uncertain significance or were negative. Of the 25 tumors evaluated for LOH, loss of the wild-type allele was detected in nine (36%), in which one of the genes has an unknown association with sarcomas (MITF). To explore new candidate genes, 9 patients with chondrosarcomas or ultra-rare sarcomas negative for GPVs were included in tumor exome and germline sequencing analysis. In the germline analysis, there were prioritized variants in 10 known CPGs and 22 genes with loss-of-function and missense variants in which the relationship with hereditary cancer is unknown. Only one variant was found in a sarcoma-associated gene (RECQL4) and in an emergent gene (BRCA2). A pathogenic variant in the RAD50 gene was detected in a patient with fibromyxoid sarcoma. An alteration in COL7A1 gene was observed in two different tumors. In the somatic analysis, there were found potentially clinically significant alterations in three genes (TP53, PTCH1, CREBBP), since they are genes with a known association with sarcomas. Other mutated genes were also identified, some of them included in biological pathways that may be interesting for sarcomas, such as VPS16 and MYF6. However, in order to be able to perform genotype-phenotype associations of exome data, other evidences are needed for both germline and somatic evaluation, such as transcriptome analysis and co-segregation. With panel data, our results highlight a high rate of GPVsin CPGs in young Brazilian patients with sarcoma (21.5% including patients carrying the TP53:p.Arg337His variant), even in patients with no family history of cancer. Our findings reveal that 1 in each 5 patients with sarcomas under 40 years old presented a GPV, even in patients without family history of cancer. GPVs rates varied from 0% to 33% across sarcoma subtypes and exhibited specific gene-subtypes associations. This pinpoints the urgency of implementing appropriated genetic screening strategies for these individuals and their families.

Avaliação do perfil de microRNAs exossomais em portadores de hipercolesterolemia familial / Evaluation of the profile of exosomal microRNAs in patients with familial hypercholesterolemia

A Hipercolesterolemia Familial (HF) é uma doença hereditária do metabolismo lipídico que causa aos portadores alta incidência de aterosclerose prematura. A HF pode ser diagnosticada clínica e geneticamente, entretanto, apenas cerca de 40% podem ter confirmados pelo diagnostico molecular. Assim, outros sistemas de diagnóstico devem ser avaliados. Ultimamente devido a estabilidade em fluidos biológicos, os exossomos circulantes apresentam grande potencial, pois carreiam um número variado de compostos e são considerados veículos de intercomunicação entre os tecidos. Sabe-se que vários RNAs são carreados nos exossomos, incluindo miRNAs, lncRNA e uma variedade de proteínas. Estes componentes podem ser marcadores de diagnóstico para várias doenças inclusive a HF e suas complicações cardiovasculares. Foram utilizadas amostras de exossomos plasmáticos provenientes de 54 pacientes HF sem uso de estatina por, no mínimo, seis semanas, e 38 indivíduos normolipidêmicos para sequenciamento de miRNAs e estudo da proteômica. Os exossomos foram isolados utilizando dois métodos precipitação química e cromatográfica de exclusão de tamanho e caraterizados utilizando: dispersão de luz dinâmica, Western blotting, rastreamento de nanopartículas (NanoSight), imunomarcação e microscopia eletrônica de transmissão. Os miRNAs e proteínas foram extraídos dos exossomos e analisados por sequenciamento de nova geração e espectrometria de massa, respectivamente. Os dados clínicos, biodemográficos e laboratoriais dos pacientes HF e controles indicaram diferenças significativas esperadas entre os grupos, indicando que foram selecionados adequadamente. A caracterização físico-química dos exossomos mostrou resultados com tamanho de ˜90nm e imunorreação positiva para tetraspaninas. O resultado do sequenciamento identificou acima 2000 miRNAs. Os miR-122- 5p e miR-21-5p apresentaram expressão aumentada no grupo HF (log2FC=1,79 e log2FC=1,27, respectivamente), e o miR-122-5p pós normalização em relação ao controle manteve significativo comparados ao controle (p=0,034). A análise comparativa entre exossomos e plasma total mostrou diferença significativa, pois foram identificadas 239 proteínas (p <0,05) diferentes entre exossomos e plasma. Em exossomos, 17 proteínas foram aumentadas e 21 diminuídas em pacientes com HF em comparação com o controle (p <0,05). Destas, seis proteínas foram mais abundantes em HF e sete proteínas foram menos abundantes em exossomos de pacientes com HF em comparação com o controle. A análise de enriquecimento por bioinformática mostrou que a maior parte dessas moléculas (miRNAs e proteínas) foram relacionadas com metabolismo lipídico, dislipidemia, aterosclerose, doença arterial coronariana, adipogênese. Assim, na busca de novos alvos como potenciais biomarcadores de diagnóstico da HF, nossos resultados da análise integrativa entre os miRNAs e as proteínas exossomais abre novas frentes de pesquisa mais bem direcionadas, para a validação desses miRNAs e proteínas exossomais

Familial Hypercholesterolemia (FH) is an inherited disease of lipid metabolism that causes a high incidence of premature atherosclerosis in patients. FH can be diagnosed clinically and genetically, however, only about 40% can be confirmed by molecular diagnosis. Thus, other diagnostic systems should be evaluated. Lately, due to stability in biological fluids, circulating exosomes have great potential, as they carry a varied number of compounds and are considered vehicles of intercommunication between tissues. Several RNAs are known to be carried on exosomes, including miRNAs, lncRNA, and a variety of proteins. These components can be diagnostic markers for several diseases including FH and its cardiovascular complications. Plasma exosome samples from 54 FH patients without statin use for at least six weeks and 38 normolipidemic individuals were used for miRNA sequencing and proteomics studies. Exosomes were isolated using two methods chemical precipitation and size exclusion chromatography and characterized using: dynamic light scattering, Western blotting, nanoparticle tracking (NanoSight), immunostaining and transmission electron microscopy. MiRNAs and proteins were extracted from exosomes and analyzed by next-generation sequencing and mass spectrometry, respectively. Clinical, biodemographic and laboratory data of FH patients and controls indicated significant expected differences between the groups, indicating that they were appropriately selected. The physicochemical characterization of exosomes showed results with a size of ˜90nm and positive immunoreaction for tetraspanins. The sequencing result identified above 2000 miRNAs. miR-122-5p and miR-21-5p showed increased expression in the FH group (log2FC=1.79 and log2FC=1.27, respectively), and miR122-5p after normalization in relation to the control remained significant compared to the control (p=0.034). The comparative analysis between exosomes and total plasma showed a significant difference, as 239 different proteins (p < 0.05) were identified between exosome and plasma. In exosomes, 17 proteins were increased and 21 decreased in FH patients compared to control (p < 0.05). Of these, six proteins were more abundant in FH and seven proteins were less abundant in exosomes from patients with FH compared to the control. Bioinformatics enrichment analysis showed that most of these molecules (miRNAs and proteins) were related to lipid metabolism, dyslipidemia, atherosclerosis, coronary artery disease, adipogenesis. Thus, in the search for new targets as potential diagnostic biomarkers of FH, our results of the integrative analysis between miRNAs and exosomal proteins opens new and better-directed research fronts for the validation of these miRNAs and exosomal proteins

Genomic analysis on Brazilian strains of Anaplasma marginale / Análise genômica de cepas Brasileiras de Anaplasma marginale

Abstract Anaplasma marginale is a vector-borne pathogen that causes a disease known as anaplasmosis. No sequenced genomes of Brazilian strains are yet available. The aim of this work was to compare whole genomes of Brazilian strains of A. marginale (Palmeira and Jaboticabal) with genomes of strains from other regions (USA and Australia strains). Genome sequencing of Brazilian strains was performed by means of next-generation sequencing. Reads were mapped using the genome of the Florida strain of A. marginale as a reference sequence. Single nucleotide polymorphisms (SNPs) and insertions/deletions (INDELs) were identified. The data showed that two Brazilian strains grouped together in one particular clade, which grouped in a larger American group together with North American strains. Moreover, some important differences in surface proteins between the two Brazilian isolates can be discerned. These results shed light on the evolutionary history of A. marginale and provide the first genome information on South American isolates. Assessing the genome sequences of strains from different regions is essential for increasing knowledge of the pan-genome of this bacteria.

Resumo Anaplasma marginale é um patógeno transmitido por vetores que causam uma doença conhecida como anaplasmose. Até a presente data, não há genomas sequenciados de cepas brasileiras. O objetivo deste estudo foi comparar o genoma completo das cepas brasileiras de A. marginale (Palmeira e Jaboticabal) com os genomas de cepas de outras regiões (cepas dos EUA e Austrália). As sequências dos genomas das cepas brasileiras foram obtidas mediante sequenciamento de nova geração. As "reads" foram mapeadas usando-se como referência o genoma de A. marginale da cepa Florida. Foram identificados polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) e analisadas inserções/deleções (INDELs). As duas linhagens brasileiras se agruparam em um clado particular que, por sua vez, agrupou-se em um grupo maior junto com as linhagens norte-americanas. Além disso, foram identificadas diferenças significativas nas proteínas de superfície entre os dois isolados brasileiros. Esses resultados lançam luz sobre a história evolutiva de A. marginale e fornecem as primeiras informações de genomas de isolados sul-americanos. Avaliar as sequências de genomas de cepas de diferentes regiões é essencial para aumentar o conhecimento do pan-genoma dessa bactéria.

Evidence and practices of the use of next generation sequencing in patients with undiagnosed autosomal dominant cerebellar ataxias: a review / Evidências e práticas do uso do sequenciamento de nova geração em pacientes com ataxias cerebelares autossômicas dominantes não diagnosticadas: uma revisão

ABSTRACT Autosomal dominant cerebellar ataxias (ADCA) are heterogeneous diseases with a highly variable phenotype and genotype. They can be divided into episodic ataxia and spinocerebellar ataxia (SCA); the latter is considered the prototype of the ADCA. Most of the ADCA are caused by polyglutamine expansions, mainly SCA 1, 2, 3, 6, 7, 17 and Dentatorubral-pallidoluysian atrophy (DRPLA). However, 30% of patients remain undiagnosed after testing for these most common SCA. Recently, several studies have demonstrated that the new generation of sequencing methods are useful for the diagnose of these patients. This review focus on searching evidence on the literature, its usefulness in clinical practice and future perspectives.

RESUMO As ataxias cerebelares autossômicas dominantes (ACAD) são doenças heterogêneas com fenótipo e genótipo altamente variáveis. Podem ser divididas em ataxia episódica e ataxia espinocerebelar (SCA), sendo este último considerado o protótipo do ACAD. A maior parte das ACAD são causadas por expansões de poliglutaminas, principalmente SCA 1, 2, 3, 6, 7, 17 e atrofia dentatorubro-palidoluisiana (DRPLA). No entanto, 30% dos pacientes permanecem sem diagnóstico após o teste para essas SCA mais comuns. Recentemente, vários estudos têm demonstrado que a nova geração de métodos de sequenciamento são ferramentas úteis para o diagnóstico desses pacientes. Esta é uma revisão sistemática da literatura, com foco em sua utilidade na prática clínica e em perspectivas futuras.

Characterization of ruminal bacteria in grazing Nellore steers / Caracterización de bacterias ruminales en novillos Nelore en pastoreo / Caraterização bacteriana ruminal em novilhos Nelore em pastejo

Abstract Background: Rumen microorganisms have developed a series of complex interactions, representing one of the best examples of symbiosis between microorganisms in nature. Conventional taxonomic methods based on culture techniques are being replaced by molecular techniques that are faster and more accurate. Objective: To characterize rumen bacterial diversity of Nellore steers grazing on tropical pastures by sequencing the 16S rRNA gene using Illumina sequencing. Methods: Three rumen-cannulated Nellore steers were used. The liquid and solid fractions of the rumen contents were processed to extract metagenomic DNA, and the V1 and V2 hypervariable regions of the 16S rRNA gene were sequenced using Illumina sequencing. Results: A total of 11,407,000 reads of adequate quality were generated, and 812 operational taxonomic units (OTUs) were found at the species level. Twenty-seven phyla were identified, and the predominant phyla were Firmicutes (23%), Bacteroidetes (14%), Proteobacteria (10%), Spirochaetes (9%), Fibrobacteres (7%), Tenericutes (5%), and Actinobacteria (2%), which represented 70% of the total phyla identified in the rumen content. Conclusion: Rumen environment in grazing Nellore steers showed high bacterial diversity, with Firmicutes, Bacteroidetes, Proteobacteria, Spirochaetes, and Fibrobacteres as the predominant phyla.

Resumen Antecedentes: Los microorganismos ruminales han desarrollado una serie de interacciones complejas que representan uno de los mejores ejemplos de simbiosis entre microorganismos en la naturaleza. Los métodos taxonómicos tradicionales basados en técnicas de cultivo están siendo reemplazados por técnicas moleculares debido a su mayor velocidad y precisión. Objetivo: Caracterizar la diversidad bacteriana ruminal de novillos Nelore mantenidos en pasturas tropicales mediante la secuenciación del gen 16S RNA utilizando la plataforma de secuenciación Illumina. Métodos: Se utilizaron tres novillos Nelore fistulados en el rumen. Las fracciones líquida y sólida del contenido ruminal fueron procesadas para la extracción del DNA meta genómico y las regiones hipervariables V1 y V2 del gen 16S rRNA fueron secuenciadas usando la plataforma Illumina. Resultados: En total, se generaron 11.407.000 lecturas de calidad adecuada, y en el nivel de especie se encontraron 812 unidades taxonómicas operacionales (OTUs). Se identificaron veintisiete filos, predominantemente Firmicutes (23%), Bacteroidetes (14%), Proteobacteria (10%), Spirochaetes (9%), Fibrobacteres (7%), Tenericutes (5%) y Actinobacteria (2%), los cuales representaron el 70% de los filos identificados en el contenido ruminal. Conclusión: El ambiente ruminal de novillos Nelore en pastoreo presenta una alta diversidad de bacterias, con dominancia de los filos Firmicutes, Bacteroidetes, Proteobacteria, Spirochaetes y Fibrobacteres .

Resumo Antecedentes: Os microrganismos ruminais têm desenvolvido uma serie de complexas interações que representam um dos melhores exemplos de simbiose entre microrganismos na natureza. Os métodos taxonômicos tradicionais baseados em métodos de cultura vêm sendo substituídos por técnicas moleculares que apresentam maior velocidade a acurácia. Objetivo: Caracterizar a diversidade bacteriana ruminal em novilhos Nelore mantidos em pastagens tropicais mediante o sequenciamento do gene 16S rRNA utilizando a plataforma de sequenciamento Illumina. Métodos: Foram utilizados três novilhos Nelore fistulados no rúmen. A fração liquida e solida do conteúdo ruminal foram processadas para extrair o DNA metagenômico, e as regiões hipervariáveis V1 e V2 do gene 16S rRNA foram sequenciadas na plataforma Illumina. Resultados: No total foram geradas 11.407.000 leituras de qualidade adequada, e 812 unidades taxonomicas operacionais (OTUs) foram identificadas no nível de espécie. Foram identificados 27 filos, e houve predominância de Firmicutes (23%), Bacteroidetes (14%), Proteobacteria (10%), Spirochaetes (9%), Fibrobacteres (7%), Tenericutes (5%) e Actinobacteria (2 %), os quais representaram 70% dos filos identificados a partir do rúmen bovino. Conclusão: O ambiente ruminal em novilhos Nelore em pastejo apresentou alta diversidade bacteriana, com Firmicutes, Bacteroidetes, Proteobacteria, Spirochaetes e Fibrobacteres como filos predominantes.

Identificação de transcritos diferencialmente expressos por Pasteurella multocida em condições de privação de ferro / Identification of differentially expressed transcripts by Pasteurella multocida iron-starved condition

Ferro (Fe) é um elemento essencial e a capacidade de adquiri-lo in vivo têm sido descrita em diversos agentes patogênicos através de fatores de virulência. Análises de transcritos durante a privação de Fe tem sido descritos através da técnica de "microarray", entretanto a técnica de RNA-seq recentemente tem demonstrado resultados superiores. Neste trabalho, o isolado de Pasteurella multocida (Pm 16759) altamente patogênico em suínos foi cultivado em duas condições com diferentes concentrações de Fe (controle e privação) com o objetivo de analisar transcritos diferencialmente expressos. O RNA total das duas condições foi extraído e sequenciado através da plataforma de nova geração Ion Torrent. Os dados foram analisados no Software Ion Reporter(tm) e processados no programa Rockhopper. Foram obtidas 1.341.615 leituras com tamanho médio de 81pb, com 96% de alinhamento com o genoma de Pasteurella multocida subsp. multocida 3480 e 98,8% de acurácia. No mapeamento das leituras das duas condições, observou-se 2,652 transcritos e destes, 177 (6,7%) foram diferencialmente expressos, sendo 93 na condição controle (Fe+) e 84 na condição de privação (Fe-). Na condição de privação de Fe, o perfil de transcritos foram associados a função de transporte celular (fbp ABC, permease de alta afinidade com Fe2+/Pb2+ e proteína periplasmática de alta afinidade com Fe2+ ), reguladores transcricionais e proteínas hipotéticas. O perfil na condição controle (Fe+) apresentou transcritos diferencialmente expressos associados ao RNAs anti-sense (asRNA) e genes do metabolismo energético (fructose-1,6-bisfosfatase). O estudo comprovou que a restrição de Fe aumenta a expressão de genes envolvidos no transporte celular, reguladores transcricionais, proteínas hipotéticas e desconhecidas e permitiu ainda a identificação de novos genes como a permease de alta afinidade com Fe2+/Pb2+ e proteina periplasmática de alta afinidade com Fe2+ , que configuram uma possível via alternativa de absorção de Fe.(AU)

Iron (Fe) is an essential element and the ability to acquire it in vivo has been described in several pathogens as virulence factors. Global analyses of transcripts during iron deprivation have been described by microarray studies, however recently RNA-seq analysis showed superior results. The high pathogenic swine strain of Pasteurella multocida (BRMSA 1113) was grown in two conditions with different concentrations of Fe (control and deprivation) in order to analyze the differentially expressed transcripts. The total RNA of the two conditions was extracted and sequenced by new generation Ion Torrent plataform. Data were analyzed in Ion Reporter(tm) Software and processed in Rockhopper software. Sequence analysis shows 1,341,615 readings with median length of 81pb, with 96% of alignment to the reference genome Pasteurella multocida strain 3489, and 98.8% accuracy. Reads mapping to genome of P. multocida in these two conditions detected 2,652 transcripts, which 177 (6.7%) were differentially expressed, with 93 in the control condition (Fe+) and 84 provided with iron deprivation condition (Fe-). In condition (Fe-), differential expressed transcript profile were associated to function of cellular transport (fbpABC, high-affinity Fe2+/Pb2+ permease and periplasmic protein probably involved in hight-affinity Fe2+ ), transcptional regulators and hypothetical proteins. The control condition (Fe+) shows differential expressed transcripts profile associated to RNA anti-sense (asRNA) energetic metabolism genes (fructose-1,6-bisphosphatase). The study showed that the Fe restriction increases the expression of genes involved in cellular transport, transcriptional regulators, hypothetical and unknown proteins, and also allowed the identification of High-affinity Fe2+/Pb2+ permease e Periplasmic protein probably involved in high-affinity Fe2+, that constitute a possible alternative route for Fe absorption.(AU)

Mutation screening of the sodium iodide symporter gene in a cohort of 105 China patients with congenital hypothyroidism / Análise de mutações no gene simportador sódio/iodeto em coorte de 105 pacientes chineses com hipotireoidismo congênito

Objective Dyshormonogenetic congenital hypothyroidism (CH) was reported to be associated with a mutation in the sodium iodide symporter (NIS) gene. The present study was undertaken in the Guangxi Zhuang Autonomous Region of China, to determine the nature and frequency of NIS gene mutations among patients with CH due to dyshormonogenesis. Subjects and methods: Blood samples were collected from 105 dyshormonogenetic CH patients in Guangxi Zhuang Autonomous Region, China, and genomic DNA was extracted from peripheral blood leukocytes. All exons of the NIS gene together with their exon-intron boundaries were screened by next-generation sequencing. Results Two silent variations (T221T and T557T) and one missense variation (M435L), as well as two polymorphisms (rs200587561 and rs117626343) were found. Conclusions Our results indicate that the NIS mutation rate is very low in the Guangxi Zhuang Autonomous Region, China, and it is necessary to study mutations of other genes that have major effects on thyroid dyshormonogenesis and have not as yet been studied in this population. .

Objetivo O hipotireoidismo congênito disormonogenético (CH) foi relatado como associado a uma mutação no gene simportador sódio/iodeto (NIS). O presente estudo foi feito na região autônoma de Guangxi Zhuang na China para se determinar a natureza e a frequência das mutações no gene NIS entre pacientes com CH causado por disormonogênese. Sujeitos e métodos: Amostras de sangue foram coletadas de 105 pacientes com CH disormonogenéticos e o DNA genômico foi extraído de leucócitos do sangue periférico. Todos os éxons do gene NIS, junto com seus limites éxon-íntron, foram analisados por sequenciamento de nova geração. Resultados Foram encontradas duas variações silenciosas (T221T e T557T) e uma variação missense (M435L), assim como dois polimorfismos (rs200587561 e rs117626343). Conclusões Nossos resultados indicam que a taxa de mutação em NIS é muito baixa na região de Guangxi Zhuang. É necessário estudar mutações de outros genes que tenham efeitos maiores na disormonogênese da tiroide e que ainda não tenham sido estudados nesta população. .